Клетка растения содержит полный набор инструкций для воссоздания всего организма. Её можно откатить до эмбрионального состояния или заставить заново отрастить растение целиком.
Методу почти 100 лет, но прямо сейчас он стал промышленным и начал заметно менять рынки.
Особенно это касается косметики, медизделий и фармы. Многие комплексы дешевле получить из вагона ромашек в биореакторе, чем синтезировать каждый компонент по отдельности. Редкий хмель, который был нужен пивоварне, за один цикл клонирования (около месяца) выдал 119 растений из одного образца.
Так уже спасают редкие виды, так реанимировали Silene stenophylla 32-тысячелетней давности, которую нашли под слоем вечной мерзлоты, и так сейчас клонируют редчайшие коллекционные растения.
Добро пожаловать в мир рибофанка: теперь можно фармить любое растение на электричестве очень быстро!
Биологическая магия, или как заставить клетку забыть, кем она была
В основе метода лежит такое свойство, как тотипотентность.
Практически любая растительная или животная клетка хранит полный набор генетических инструкций для воссоздания целого организма.
Чтобы активировать этот потенциал, клетку нужно заставить забыть, кем она была — листом, стеблем или корнем.
Этот процесс называется дедифференциацией. При стрессе (например, ранении) и под действием гормонального сигнала клетка сбрасывает свою специализацию и возвращается в состояние, близкое к стволовой.
Теперь перед ней открыты все пути.
В стерильных лабораторных условиях у такой «обнулённой» клетки развитие идёт по двум основным сценариям:
Первый — соматический эмбриогенез, высший пилотаж биотехнологии. Соматическая (телесная, неполовая) клетка перепрограммируется настолько глубоко, что начинает вести себя как оплодотворённая яйцеклетка. Она проходит все стадии развития зародыша: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную. Иногда эмбрионы вырастают прямо на поверхности листа или стебля — это прямой путь. Чаще сначала образуется каллус — бесформенная делящаяся масса клеток, похожая на опухолевую ткань, но без злокачественного роста. И уже из него при смене условий формируются зародыши. Метод хорошо подходит для создания «искусственных семян» и масштабного клонирования.
Второй сценарий — органогенез de novo. Здесь клетка не притворяется эмбрионом, а сразу строит недостающий орган. Кусочек стебля можно заставить отрастить корни. Корень — дать побеги. Итальянские исследователи из Университета Палермо использовали именно этот подход для размножения хмеля сорта Cascade. Они взяли побеги с фермы на Сицилии, жёстко простерилизовали спиртом и отбеливателем, нарезали на кусочки с одной почкой и рассадили по чашкам Петри с девятью вариантами питательной среды.
Гормональный пульт управления
Как клетка понимает, что ей выращивать, — вершки или корешки?
Этим управляет баланс фитогормонов в питательной среде.
Правило, которое сформулировали Скуг и Миллер ещё в 1957 году, до сих пор лежит в основе большинства протоколов:
-
Много цитокининов + мало ауксинов — получаете побеги.
-
Много ауксинов + мало цитокининов — получаете корни.
-
Равные пропорции дают каллус: клетки просто делятся во все стороны, образуя биомассу без органной структуры.
В эксперименте с хмелем итальянцы тестировали три типа цитокининов в разных концентрациях. Лучше всего сработала среда с высокой дозой TDZ (тидиазурона) — 2 мг на литр: 89% почек дали новые побеги за три месяца. Среда с BAP (бензиладенином) обеспечила больше побегов на одну почку: в среднем — 3,2, но TDZ оказался стабильнее по выживаемости и развитию.
Проблема возникла с каллусом. В одной из сред он образовался у 93% растений — это плохо, потому что ведёт к мутациям.
Потом пришло время укоренения.
У побегов не было корней, а без них в земле они умрут.
Стебли пересадили на среды с ауксинами — гормонами, запускающими рост корней. Победила среда с добавлением 1 мг на литр IAA (индолилуксусной кислоты). 72% растений пустили корни длиной в среднем 1,17 см. Выживаемость побегов составила 90%. Другой ауксин, IBA (индолилмасляная кислота), показал себя хуже: корни росли короче и реже, укоренение — всего 50%.
Самое забавное в серьёзной науке — названия генов.
Есть, например, ген, который заставляет растение безудержно создавать эмбрионы. Его окрестили BABY BOOM (BBM). Ген беспорядочных корней — SCARECROW (SCR), или «Пугало»: мутанты без него выглядят… ну, страшновато. А комплекс FUSCA3 и LEAFY COTYLEDON получил аббревиатуру LAFL (звучит как laugh). На деле это мощный регулятор развития растения.
Косметика и фарма: почему пробирка лучше поля
Для производителей люксовой косметики или лекарств растение из дикой природы — это головная боль. Засуха — мало активных веществ в сырье. Дожди — гниль и потери. Плюс насекомые, пестициды и тяжёлые металлы из почвы.
Культура тканей решает все эти проблемы разом.
Химический синтез даёт одну чистую молекулу, например, синтетический витамин С. Растение производит фитокомплекс, то есть сложную смесь сотен соединений: полифенолов, флавоноидов, терпенов, пептидов. Они работают в команде, усиливая действие друг друга и повышая биодоступность. Биотехнологический синтез позволяет получать этот природный коктейль в стерильных условиях и точно управлять его составом.
Большинство ценных для нас веществ — вторичные метаболиты — растения вырабатывают в ответ на угрозу. Антиоксиданты защищают от солнца, токсины — от насекомых, антибиотики — от грибков. В биореакторе клеточную культуру можно намеренно подвергнуть контролируемому стрессу, чтобы она начала вырабатывать защитные соединения в промышленных масштабах.
Этот процесс называется элиситацией.
Логика предельно простая: «испугай растение — получишь лекарство».
В ход идут разные триггеры.
Абиотические элиситоры — UV-облучение, изменение температуры, соли тяжёлых металлов, изменение осмотического давления сахаром. Можно использовать биотические: кусочки клеточных стенок грибов или бактерий, сигнальные молекулы вроде жасмоновой кислоты. Клетки «решают», что на них напали, и запускают массированную выработку защитных веществ — тех самых, которые потом попадут, например, в омолаживающий крем. Концентрация активных соединений в биомассе in vitro может быть в десятки раз выше, чем у растения с грядки.
Практика давно вышла за пределы лабораторий.
Paclitaxel — один из ключевых препаратов против рака груди и яичников — раньше добывали из коры тиса, при этом дерево погибало. Сейчас его получают в биореакторах с культурой клеток тиса. Шиконин — красный пигмент и антибиотик — производит в биореакторах японская компания Mitsui Chemicals. Elelyso — лекарство от болезни Гоше — стал прорывом: человеческий фермент синтезируют клетки моркови. Это первый одобренный в мире (в 2012 году) препарат такого типа. А при выращивании корней горца многоцветкового в 500-литровом биореакторе удалось получить 287 мг фенольных соединений на литр — для промышленного процесса это высокая концентрация.
И, наконец, стандартизация и безопасность. Каждая партия продукта имеет одинаковый состав, потому что клоны генетически идентичны и растут в абсолютно одинаковых условиях. В биореакторе нет почвы, а значит, нет тяжёлых металлов. Нет насекомых — не нужны инсектициды. На выходе получается предсказуемое чистое сырьё, идеальное для гипоаллергенной и экокосметики.
«Бородатые корни»: живые биофабрики, заражённые бактерией
Существует отдельная и особенно эффективная технология — культура «бородатых корней» (hairy roots). В природе есть почвенная бактерия Agrobacterium rhizogenes с редкой способностью встраивать фрагмент своей ДНК в геном растения. По сути, это естественная генная инженерия, которая работала миллионы лет до того, как это стало мейнстримом.
В смысле до того, как люди придумали CRISPR.
Встроенный генетический фрагмент перепрограммирует клетки и запускает формирование корней.
Но не обычных.
Трансформированные корни растут в жидкой среде годами и не требуют дорогих фитогормонов, всё необходимое синтезируя самостоятельно. Они теряют чувство гравитации и растут во все стороны, заполняя весь объём густой плотной «бородой».
В отличие от каллуса, который склонен к мутациям, «бородатые корни» стабильны. Они производят ровно то, что от них требуется, без деградации свойств со временем. И главное, эти корни — чемпионы по производству вторичных метаболитов. Именно из таких культур часто получают шиконин (краситель и антисептик), гинзенозиды из женьшеня и многие алкалоиды для фармацевтики.
Тёмная сторона пробирки
Если этот метод так хорош, то почему растения до сих пор выращивают в полях?
Ответ прост: это дорого, сложно и рискованно.
Главная проблема — стоимость конечного продукта. До 60–70% себестоимости здесь съедает ручной труд. Разделение микропобегов, пересадка на свежую среду — это ювелирная ручная работа, требующая квалифицированного персонала. Роботы пока плохо справляются с нежными и разнообразными по форме растениями. Каждую банку надо открыть, достать растение, аккуратно разрезать, пересадить в новую среду, закрыть.
Тысячи раз. Каждый день.
Инфраструктура тоже недешёвая. Это не теплица, а стерильные помещения с фильтрацией воздуха, ламинарными боксами и автоклавами. Растениям нужен свет (лампы горят по 16 часов в сутки) и, что критичнее, нужно кондиционирование. Круглый год необходимо поддерживать точную температуру (+20…25°C) с непрерывным отводом тепла от ламп.
Счета за электричество сопоставимы с бюджетом небольшого предприятия.
Отдельный кошмар — контаминация. Это невидимый враг любой лаборатории. Питательная среда для растений (сахар, витамины, аминокислоты) — шведский стол для бактерий и грибков. Одна спора, занесённая с рук оператора или через плохой фильтр, за несколько дней превратит банку с клонами в плесневелый комок.
Но внешнее заражение — ещё полбеды. Самая коварная проблема — это эндофиты: бактерии, живущие внутри тканей растения. В культуре in vitro они могут месяцами дремать, а потом, при смене среды или стрессе, внезапно размножиться и погубить тысячи растений уже на этапе масштабирования.
Казахстанские учёные из Торайгыровского университета в Павлодаре проанализировали методы борьбы с этой проблемой.
Классический подход — поверхностная стерилизация. Картофель трясут в растворе хлорида ртути от двух до восьми минут, виноград купают в хлорке 14 минут. Метод рабочий, но грубый: ртуть токсична, а хлорка может сжечь нежные ткани. К тому же микроорганизмы могут вырабатывать устойчивость по тому же принципу, что и к антибиотикам.
Короче, тонкая грань между «недомыл» и «убил химией».
Сейчас всё чаще тестируют наночастицы серебра как более мягкую альтернативу. И здесь обнаружилось неожиданное: в малых дозах серебро не только подавляет микробов, но и стимулирует рост. В опытах с гуавой добавление наночастиц серебра снизило заражение на 30%, заодно увеличив площадь листьев на 560%, а скорость размножения — на 180%. У кермека число побегов выросло более чем вдвое.
Обычно, когда живой организм дезинфицируют, ему становится плохо: вспомните, как сохнет кожа от антисептика. Здесь же растения, которые были буквально «накормлены» дезинфектором, начали расти, как на стероидах.
Но есть и обратная сторона.
Наносеребро накапливается в печени, селезёнке и лёгких — это доказано на крысах. При длительном вдыхании или проглатывании может вызывать поражения кожи и глаз. Сброс воды с наночастицами в канализацию убивает полезные бактерии в природе и вредит водным организмам.
Долгосрочных данных о влиянии серебра на мутации у самих растений пока нет. А для клонирования это критично: клон должен быть точной копией исходного растения.
Атака мутантов: сомаклональная изменчивость
Когда клетки проходят стадию каллуса, геном становится нестабильным: могут активироваться «спящие» транспозоны, «прыгающие гены», меняться число хромосом или паттерны метилирования ДНК. В итоге легко получить миллион клонов, которые выглядят, как элитный сорт, но, например, перестали цвести или потеряли устойчивость к болезням.
Для коммерческого производства, где платят за стопроцентную сортность, это катастрофа.
Эксперименты подтверждают, что способность к регенерации жёстко привязана к генетике. В исследовании 101 линии кукурузы восстановиться смогли только 49%. При этом гибриды показали почти идеальный результат — 97% успешной регенерации. Одни растения (например, табак или морковь) регенерируют легко. Другие — важнейшие злаки вроде кукурузы или пшеницы — капризничают и гибнут в пробирке.
Причём даже внутри вида один сорт может регенерировать, а другой — нет.
Поэтому в производстве стараются обходить стадию каллуса и размножать растения через меристемы — пазушные почки: это надёжнее.
Итальянцы в эксперименте с хмелем столкнулись именно с этой проблемой: несмотря на общий успех, на этапе размножения наросло много каллуса. Они считают это признаком органогенеза, но в идеале каллуса должно быть меньше, чтобы исключить генетические сбои. При этом генетического анализа взрослых растений они не проводили, то есть полную идентичность клонов материнскому растению исследование не подтверждает. Однако косвенно предполагает надёжность метода.
Шок акклиматизации: как не убить растение на финише
Растение в пробирке — это тепличный неженка. Оно живет при стопроцентной влажности, берёт сахар напрямую из среды, ему почти не нужно фотосинтезировать, и у него нет защитного воскового слоя на листьях. Устьица — поры для дыхания — часто остаются открытыми и не умеют закрываться. Если такое растение просто пересадить в горшок, то оно высохнет и погибнет за час.
Переход из in vitro в ex vivo — акклиматизация — требует постепенной адаптации: это снижение влажности, привыкание к яркому свету и запуск собственного фотосинтеза. На этом этапе гибнет значительная часть посадочного материала.
Во всё том же эксперименте с хмелем итальянцы решили эту проблему изящно. Растения достали из банок, отмыли корни от желе и высадили в специальные микробоксы с агроперлитом — стерильной крошкой из вулканического стекла, хорошо удерживающей влагу.
Поливали раствором витаминов, но уже без гормонов. Сначала микробоксы держали закрытыми, поддерживая высокую влажность, а через 15 дней начали потихоньку открывать крышки, чтобы приучать растения к сухому воздуху. Потом перенесли их в холодную теплицу.
Результат: выживаемость — 99,1%. Из 150 исходных кусочков в итоге получили 119 готовых к полю здоровых растений.
Объёмы рынка, и кто на нём зарабатывает
Рынок микроклонального размножения огромен и продолжает расти. Он обслуживает не только косметологию, но также декоративное садоводство и сельское хозяйство.
Только в Западной Европе работает около 250 коммерческих лабораторий, производящих суммарно более 212 млн растений в год. В США — порядка 100 крупных биофабрик, топовые игроки ежегодно производят по 15–20 млн растений каждый. Нидерланды — крупнейший отраслевой хаб, они держат основную долю рынка декоративных культур, прежде всего — орхидей и горшечных растений.
Франция — яркий пример того, как технология прижилась в масштабе страны. 94% всех выращиваемых и продаваемых цветов получено методом микроклонирования. То есть почти все цветы во французских магазинах никогда не видели обычной почвы: они «родились» в стерильных банках на желе.
При этом центр тяжести рынка постепенно смещается в Азию — Индию, Китай, Таиланд — за счёт более дешёвой рабочей силы и огромного внутреннего спроса. Индия, в частности, стала лидером в клонировании лесных и плантационных культур: тика, эвкалипта, бамбука и бананов.
Структура производства при этом довольно разношёрстная. Самый массовый сегмент — это декоративные растения. Орхидеи клонируются десятками миллионов, к ним добавляются фикусы, спатифиллумы, антуриумы, розы. В сельском хозяйстве ключевые культуры — это бананы (которые не размножаются семенами), картофель (для получения безвирусного семенного фонда), клубника, сахарный тростник. В лесном хозяйстве микроклональное размножение нужно для быстрого восстановления лесов и создания плантаций под бумагу и древесину, прежде всего — эвкалипта, тополя и хвойных пород.
Технологии будущего и интересные факты
Банан — самая популярная ягода в мире и основа рациона миллионов людей в тропиках. Но культурные бананы сорта Кавендиш стерильны: у них нет семян. Их размножают вегетативно, что приводит к накоплению вирусов и уязвимости перед грибком («Панамской болезнью»), который уничтожает плантации по всему миру.
Культура тканей стала единственным спасением индустрии. Берут самую верхушку точки роста — меристему, где клетки делятся быстрее, чем вирус успевает их заразить — и получают миллионы оздоровлённых, свободных от вирусов саженцев.
Так плантации можно перезапустить с чистого листа.
Ученые придумали, как обойти сложную акклиматизацию. Соматические эмбрионы упаковывают в капсулу из альгината — водорослевого геля с питательными веществами и фунгицидами. Получается «искусственное семя», которое можно сеять прямо в поле механической сеялкой. Это дешевле пересадки живых растений и решает проблему ручного труда.
Подбор идеальной среды для нового растения — это метод проб и ошибок, который может занять годы. Нужно варьировать концентрации солей, сахаров и нескольких видов гормонов, а каждая комбинация требует месяцев наблюдений. Сейчас для ускорения процесса привлекают нейросети: они анализируют генотипы и составы сред. Вместо бесконечных попыток «пять минут в спирте или семь минут в хлорке» выдают рецепт, при котором и микробы умирают, и растение выживает.
Но не все растения рады попасть в пробирку.
Древесные породы, особенно хвойные и старые деревья, считаются «рекальцитратными», то есть упрямыми. Они отказываются расти in vitro, выделяют фенолы, которые отравляют среду (она чернеет), или не дают корней.
Это один из главных барьеров в области клонирования. Если его преодолеть, то можно будет клонировать элитные вековые деревья с уникальной древесиной. Представьте: нашли в тайге 300-летнее дерево и через несколько лет из его кусочка получили тысячу идентичных.
Пока это в основном мечта, но работа идёт.
Всего лишь 6% высших растений изучено с точки зрения фармакологии и около 15% — на фитохимию вообще.
Многие лекарственные вещества слишком хитрые — они содержат множество хиральных центров и нестабильных связей. Синтезировать их в химической лаборатории либо невозможно, либо безумно дорого. Остаётся старый метод: идти в лес или поле и собирать траву. Но сбор диких редких растений ведёт к их уничтожению, а урожай активных веществ сильно зависит от фазы луны погоды и почвы.
Культура тканей предлагает другой путь. Вместо того чтобы выращивать целое дерево ради грамма вещества из его коры, выращивают только нужные клетки или «бородатые корни» в биореакторе. Клетки плавают в питательном бульоне, получают сахар, минералы, свет и производят нужные соединения круглосуточно вне зависимости от сезона или географии.
Когда стекло побеждает землю
Метод культуры тканей работает на весь спектр отраслей: косметика получает чистые стандартизированные активы; фермеры — здоровый посадочный материал; экологи — способ сохранить исчезающие виды без изъятия их из среды; пивовары быстро размножают редкий хмель; фармацевты производят сложнейшие молекулы, недоступные химическому синтезу.
Короче говоря, культура тканей — не революция ради революции. Просто когда нужно спасти банановую индустрию от грибка, восстановить растение из Красной книги или получить тонны антиоксидантов без пестицидов и тяжёлых металлов, выясняется, что других вариантов особо-то и нет.
Автор: Alex_GT2
